Preliminary Safety Evaluation …

Preliminary Safety Evaluation ...

Astratto

INTRODUZIONE

Abbiamo isolato una nuova Bacteroides xylanisolvens ceppo da feci umane. I nostri dati non pubblicati preliminari suggeriscono che questo ceppo può possedere proprietà immuno-modulatori ed è in grado di produrre catene breve grassi acidi (propionato, succinato) con potenziali effetti sulla salute-benefici. Ecco a voi la valutazione della sicurezza preliminare di questa nuova B. xylanisolvens ceppo (DSM 23964).

MATERIALI E METODI

Abbreviazioni.

BLAST, strumento di ricerca allineamento locale di base; dNTP, trifosfato deossinucleoside; DSMZ, Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari; IBD, malattia infiammatoria intestinale; KGF, fattore di crescita dei cheratinociti; MEGA, molecolare analisi genetica evolutiva; MIC, minima concentrazione inibente; NCCLS, National Committee on Clinical Laboratory Standards; OD, densità ottica; PCR, reazione a catena della polimerasi, RAPD, amplificato in modo casuale DNA polimorfico; RT-PCR, trascrittasi inversa PCR; SI, saccarasi isomaltasi; OMS, Organizzazione Mondiale della Sanità.

ceppi batterici.

identificazione biochimica.

L’identificazione biochimica del ceppo isolato DSM 23964 è stata eseguita con un rapido 32A ID e API 20A kit per il test biochimico (bioMrieux, Marcy I’Etoile, Francia) secondo il protocollo del produttore.

16S rRNA gene sequenziamento e l’analisi filogenetica.

coppie di primer e le condizioni di PCR utilizzato per rilevare i geni di virulenza di ceppo DSM 23964

ibridazione DNA-DNA.

modello RAPD e genotipo.

Effetto del succo gastrico e intestinale sulla vitalità del ceppo DSM 23964.

MIC.

profilo di resistenza di B. xylanisolvens DSM 23964 verso antibiotici

Determinazione di plasmidi.

(io) CFIA gene.

(Ii) Cepa e cfxA geni.

(Iii) bft gene.

(Iv) ompW gene.

PCR no. 7, come descritto nella Tabella 1 mostra il primer e le condizioni di PCR per la rilevazione della membrana esterna gene codificante la proteina TonB-linked ompW con una lunghezza del frammento di 468 bp (49). Bacteroides caccae DSM 19024 è stato utilizzato come un ceppo di controllo.

(V) upaY. upaZ wcfR. e wcfS geni.

Determinazione di enzimi extracellulari e fattori patogeni.

Le attività enzimatiche extracellulari di B. xylanisolvens DSM 23964 sono stati determinati come segue.

(I) l’attività DNasi.

(Ii) chondroitinase e attività di ialuronidasi.

(Iii) l’attività emolisina.

(Iv) l’attività Collagenasi.

(V) l’attività della neuraminidasi.

Determinazione di adesione cellulare del ceppo DSM 23964 a cellule Caco-2.

RISULTATI

Microbiologiche e biochimiche.

caratteristiche biochimiche del ceppo DSM 23964 e membri connesse del genere Bacteroides

16S rRNA sequenziamento del gene.

Sulla base di una sequenza di 480 bp dai geni 16S rRNA, abbiamo costruito un albero filogenetico per ceppo DSM 23964 (Fig. 1 A). In base a questo, ceppo DSM 23964 aveva una similarità di sequenza 16S rRNA pari al 100% ed ha formato un unico cluster con B. xylanisolvens DSM 18836. Le relazioni con altre specie affini erano di livelli significativamente più bassi, con il 97,5%, 94,2% e 92,2% di somiglianza a B. ovatus ATCC 8483, B. thetaiotaomicron ATCC 29148, e B. finegoldii DSM 17565, rispettivamente.

rappresentazione filogenetica e profilo RAPD di B. xylanisolvens DSM 23964. (A) Rappresentazione filogenetica di diverso Bacteroides ceppi sulla base di sequenze di geni 16S rRNA. La barra di scala rappresenta 0,01 sostituzioni di giocatori per nucleotide posizione. bootstrap .

ibridazione DNA-DNA.

Al fine di identificare definitivamente ceppo DSM 23964, sono stati eseguiti esperimenti di ibridazione DNA-DNA. Confermando i risultati del sequenziamento del gene 16S rRNA, una somiglianza di 98.65% è stato identificato tra il ceppo DSM 23964 e B. xylanisolvens DSM 18836. somiglianza di B. ovatus ATCC 8483, B. thetaiotaomicron ATCC 29148, e B. finegoldii DSM 17565 raggiunto 26,9%, 28,65% e 25,2% rispettivamente.

RAPD impronte digitali di B. xylanisolvens DSM 23964.

RAPD profiling usando arbitrarie 10-mer primer oligonucleotidi è stato utilizzato per caratterizzare ceppo DSM 23964 e per distinguerlo da B. xylanisolvens DSM 18836 fino al livello di sforzo. Come mostrato in Fig. 1 B, ceppo DSM 23964 ha presentato un profilo RAPD distinta rispetto al ceppo di riferimento B. xylanisolvens DSM 18836, indicando che la DSM 23964 è un nuovo ceppo.

Effetto del succo gastrico e intestinale sulla vitalità del ceppo DSM 23964.

Per esaminare l’effetto di un passaggio attraverso il tratto gastrointestinale, i batteri sono stati sottoposti all’azione dei succhi gastrici e intestinali simulati. Il tasso di sopravvivenza per il B. xylanisolvens DSM 23964 ceppo nel succo gastrico era superiore al 90% dopo 180 min e oltre 96% dopo 240 min di esposizione al succo intestinale (dati non mostrati).

La resistenza agli antibiotici di B. xylanisolvens DSM 23964.

Rilevamento di plasmide (s) in B. xylanisolvens DSM 23964.

Per studiare il potenziale presenza di plasmide (s) in ceppo DSM 23964, materiale DNA plasmide è stato isolato dal ceppo B. xylanisolvens DSM 23964 e da due ceppi di controllo, E. coli DSM 3876 e E. coli DSM 6202, che contengono le low-copia-numero plasmidi RP4 (60 kb) e, pSC101 (9,4 kb), rispettivamente. Questi ceppi sono stati specificamente usati come controllo, perché la maggior parte dei plasmidi precedentemente identificati all’interno ceppi del genere Bacteroides variava tra i 3 ei 80 kb. Le misure della concentrazione plasmide DNA a 260 nm ha rivelato l’assenza di DNA nella preparazione plasmide del ceppo DSM 23964. Esecuzione preparativi plasmide su un gel di agarosio confermato l’isolamento di entrambi i plasmidi low-copy-numerici da ceppi di controllo e l’assenza di materiale plasmide rilevabile da B. xylanisolvens DSM 23964. concludiamo che ceppo DSM 23964 non contiene plasmide con una dimensione entro il limite isolamento del kit (Tabella 4).

Rilevazione di fattori di virulenza di B. xylanisolvens DSM 23964

Identificazione delle attività lattamasi.

Per caratterizzare l’attività lattamasi del ceppo DSM 23964, PCR specifici sono stati eseguiti per ciascuno dei geni lattamasi, CFIA. cfxA. e Cepa. noto per il genere Bacteroides. I risultati presentati nella Tabella 4 indicano che il ceppo B. xylanisolvens DSM 23964 contiene solo il Cepa gene.

I geni codificanti fattori di virulenza in genere Bacteroides .

Per investigare la presenza del B. fragilis enterotossina (Bft), abbiamo fatto una specifica PCR per la bft gene. Nel caso del polisaccaride capsulare PS A, PCR specifici per le fasi di lettura aperte altamente conservate upaY e upaZ (A monte dei geni biosintesi di PS A) e per i geni più importanti, wcfR (Codifica di un aminotransferasi), e wcfS (Che codifica una glycosyltransferase), sono stati progettati. Come mostrato nella Tabella 4. ceppo B. xylanisolvens DSM 23964, a differenza B. fragilis ATCC 43858, non possiede la bft gene. Inoltre, i geni wcfR e wcfS (Tabella 4) e le fasi di lettura aperte upaY e upaZ non poteva essere rilevato (dati non mostrati).

Determinazione di enzimi extracellulari e fattori patogeni.

adesione di B. xylanisolvens DSM 23964 a cellule Caco-2.

L’analisi molecolare del legame del ceppo DSM 23964 a cellule Caco-2. (A) GAPDH e isomaltasi saccarosio. Lanes: 1, 100 bp DNA Ladder (Bioline); 2, primo giorno; 3, terzo giorno; 4, sesto giorno; 5, ottavo giorno; 6, 10 ° giorno; 7, 13 ° giorno; 8, 14 ° giorno, 9, negativo .

DISCUSSIONE

Seguendo le raccomandazioni per la valutazione della sicurezza iniziale di un nuovo ceppo senza una storia di utilizzo nell’industria alimentare (10 52), abbiamo eseguito un esame approfondito tassonomica di questo ceppo e indagato il suo potenziale di virulenza in dettaglio.

Vista in prospettiva.

Con oltre 100 trilioni di batteri, il microbiota intestinale umano contiene una straordinaria e quasi inesplorata la ricchezza dei potenziali soggetti e funzioni probiotici. Infatti, fino ad oggi solo una piccola frazione è stata considerata e valutata per eventuali proprietà probiotiche. Sviluppare il primo probiotico Bacteroides ceppo può portare alla identificazione di nuove proprietà probiotiche e un’espansione di campi di applicazione di probiotici e spingere in tal modo i confini della ricerca probiotico oltre le linee tradizionali.

RINGRAZIAMENTI

Siamo grati a Heike Schmidt, Sigrid Wiese, Sabine Schulze, e Anja Alfandega per l’assistenza tecnica. Ringraziamo Alberto Quesada Molina dalla Universidad de Extremadura, Spagna, per la fornitura del B. ovatus ceppi MN23 e MN7.

Related posts

  • Problemi di sicurezza in Controllo letto …

    Molte tecniche di controllo letto bug presente alcuni potenziali problemi di sicurezza. Prestare attenzione a questi problemi nella scelta e l’attuazione di metodi di controllo. Pesticidi nella scelta e utilizzando …

  • La sicurezza e l’attività clinica di …

    I pazienti SINTESI Contesto con carcinoma a cellule squamose recidivante o metastatico della testa e del collo hanno poche opzioni di trattamento. Uno studio ha valutato la sicurezza, la tollerabilità e antitumorale …

  • Segnali di sicurezza arachidi, allergia alimentare …

    Le allergie alimentari tra cui allergie arachidi hanno un potenziale di causare gravi reazioni, addirittura mortali. Posta allergia alle arachidi Segni nelle scuole, asilo nido per informare patroni di una nocciolina gratuito …

  • Pratico Neurologia – Valutazione …

    Delineazione di dolore al collo può essere difficile a causa del numero di potenziali generatori di dolore nella regione della testa e del collo che hanno modelli di riferimento simili. modelli di dolore si sovrappongono spesso portano a …

  • Sicurezza nell’utilizzo di metallo tracheostomia …

    Ugeskr Laeger. 1994 28 mar; 156 (13): 1960-2. Abstract La rottura di un tubo endotracheale in acciaio inox ha provocato la morte di un uomo di 19 anni. Indagini tecniche identificate corrosione …

  • Peanut Allergie di sicurezza per bambini …

    D. Quali sono alcuni dei problemi che affliggono il neonato arachidi-allergiche e bambino? A. Si consideri questo esempio reale: come i bambini I bambini sono colpiti Purtroppo, questa situazione ideale è raramente …